Estradiol

ESTRADIOL EIA KIT
INSTRUÇÕES DE USO
ENZIMAIMUNOENSAIO PARA DETERMINAÇÃO
O Estradiol conjugado com peroxidase, não ligado, é removido com lavagens. Então, uma solução de TMB é adicionada e incubada QUANTITATIVA DE ESTRADIOL EM SORO OU
resultando no desenvolvimento de uma coloração azul. A adição de um PLASMA HUMANO
ácido forte à mistura paralisa a reação e produz uma coloração SOMENTE PARA USO DIAGNÓSTICO “
espectrofotometricamente em 450 nm. A intensidade da cor formada é IN VITRO”
inversamente proporcional à concentração de Estradiol na amostra. Uma curva padrão é obtida locando as concentrações dos calibradores SINONÍMIA
versus suas absorbâncias. As concentrações de amostras e controles são comparadas paralelamente com os calibradores. FINALIDADE
Para determinação quantitativa da concentração de Estradiol (E2) em REAGENTES
Materiais inclusos no kit:
01 placa de poliestireno com 96 microcavidades (12x8) NTRODUÇÃO
destacáveis contendo Anticorpo de cabra Anti-IgG de coelho O Estradiol é um hormônio esteróide que tem um peso molecular de 272.4 daltons. É o mais potente estrógeno natural, produzido Manter a placa acondicionada dentro da embalagem plástica que principalmente pelo ovário, corpo lúteo, placenta e, em pequenas quantidades, pelo córtex adrenal e pelos testículos. Calibradores: 06 frascos com 0,5 mL cada, contendo Estradiol nas Cerca de 98% do Estradiol secretado na corrente sangüínea está ligado concentrações 0, 10, 30, 100, 300, e 1000 pg/mL e Bromonitro à globulina ligadora de hormônios sexuais (SHBG) e, em menores dioxano 0,04 g/L como preservativo. Líquidos, prontos para uso. quantidades, ligado a outras proteínas do soro, como a albumina. Anticorpo: 01 frasco com 7 mL contendo Anticorpo de coelho Anti- Somente uma pequena fração circula como um hormônio livre ou em Estradiol, corante artificial 0,001 g/dL e Bromonitro dioxano 0,04 Em mulheres não-grávidas com ciclo menstrual normal, o Estradiol é secretado durante todo o ciclo, mas existem dois picos periódicos da Conjugado: 01 frasco com 12 mL de solução tamponada em pH 7,4 contendo Estradiol Conjugado com Peroxidase, corante secreção, um por ocasião da ovulação e outro durante a metade da fase artificial 0,001 g/dL e Bromito dioxano 0,04 g/dL como preservativo. luteínica. A elevação da concentração de Estradiol é influenciada pelo mecanismo de “feedback” da pituitária, onde a influência da secreção Controle 1: 01 frasco com 0,5 mL em matriz de soro humano. Valor gonadotrófica, FSH e LH é essencial para a maturação folicular e expresso no rótulo do frasco. Líquido, pronto para uso. ovulação, respectivamente. Após a ovulação, o nível de Estradiol cai Controle 2: 01 frasco com 0,5 mL em matriz de soro humano. Valor rapidamente, até as células lúteas tornarem-se ativas, resultando em expresso no rótulo do frasco. Líquido, pronto para uso. sua ligeira elevação e estabilização na fase lútea. Durante a gravidez, o nível sérico de Estradiol materno eleva-se Substrato TMB: 01 frasco com 11 mL de solução tamponada em pH 3,5 contendo 3,3’, 5,5’- Tetrametilbenzidina 0,5 mmol/L e anteriormente ao nível do pico pré-ovulatório e permanecendo em altos Peróxido de hidrogênio 3 mmol/L e Bromonitro dioxano 0,04 g/dL As dosagens de Estradiol sérico são valiosas na avaliação das várias disfunções menstruais semelhantes à puberdade precoce ou tardia em Extremamente fotossensível. Protegê-lo da ação da luz. O garotas, primeira ou segunda amenorréia e menopausa. Altos níveis reagente deve permanecer incolor; o aparecimento da coloração de Estradiol podem ser encontrados em pacientes com síndromes azulada indica contaminação e o reagente deve ser descartado. feminilizantes, ginecomastias e tumores testiculares. Em casos de Solução de Bloqueio: 01 frasco com 11 mL de solução de Ácido infertilidade, as dosagens de Estradiol são usualmente utilizadas para monitorar a indução da ovulação após tratamento com, por exemplo, Materiais necessários, mas não inclusos:
citrato de clomifenol, liberação do hormônio LH (LH-RH), ou gonadotrofina exógena. Durante a hiper-estimulação ovariana para fertilização “ in vitro” (IVF), as concentrações séricas de Estradiol são monitoradas diariamente para otimizar o tempo da administração da gonadotrofina coriônica humana (hCG) e coleta do óvulo. PRINCÍPIO DO TESTE
O teste é baseado no princípio de ligação competitiva entre o Estradiol da amostra e Estradiol-HRP conjugado, com uma quantidade constante de anti-Estradiol de coelho. O Estradiol do soro liga-se a um anticorpo de coelho em solução, e o complexo resultante é capturado por um Leitora de microplaca que possua filtro com banda de passagem anticorpo de cabra anti-IgG de coelho impregnado nas cavidades. de até 10nm e leitura média de densidades ópticas de 0-3 D.O. em Simultaneamente, adiciona-se à placa uma solução de Estradiol conjugado com Peroxidase, que irá competir com o Estradiol do soro para se ligar ao anticorpo anti- Estradiol de coelho. ARMAZENAMENTO DO KIT E MANUSEIO
PROCEDIMENTO
1. O Kit deve ser armazenado entre 2 e 8°C. 1. Colocar o número necessário de cavidades no suporte. 2. A microplaca deve ser mantida sempre em sua embalagem, bem 2. Pipetar 25 µL de padrões, controles e amostras nos poços fechada e com dessecante para proteger da umidade. 3. Os reagentes são estáveis até a data de expiração do kit. 3. Adicionar 100 µL de Conjugado em todos os poços. 4. Evitar exposição dos reagentes ao calor, luz solar ou luz forte 4. Adicionar 50 µL de Anticorpo em todos os poços. Homogeneizar através de movimentos circulares. É importante uma PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
5. Incubar 90 minutos em temperatura ambiente (18-25°C). 6. Desprezar o conteúdo dos poços e lavá-los 5 vezes com água destilada ou deionizada. Invertê-los em papel absorvente, batendo Todos os reagentes foram testados e comprovados não reativos para retirar o excesso de líquido. Atenção: lavagens insuficientes para a presença de vários agentes contaminantes, em especial anticorpos Anti-HIV 1 e 2 e HbsAg. Entretanto, nenhum teste laboratorial pode assegurar com certeza absoluta que quaisquer µL de Substrato em todos os poços. Homogeneizar. 8. Incubar 10 minutos em temperatura ambiente (18-25 agentes infecciosos, incluindo vírus da Hepatite B e HIV, estejam ausentes. Tratar os reagentes, portanto, como amostras altamente infectantes como recomendam as normas da Pipetar 100µL de Solução de Bloqueio em todos os poços. Secretaria de Vigilância Sanitária local, incluindo os procedimentos com relação à manipulação e descarte dos Ler as densidades ópticas em 450-630 nm, em até 10 minutos. 2. O kit é designado para uso diagnostico ÁLCULO DOS RESULTADOS
3. Não pipetar com a boca. Não fumar, comer ou beber nas áreas Calcular a média dos valores de absorbância de cada conjunto de onde os reagentes ou amostras estiverem sendo manuseados. 2. Preparar uma curva padrão locando a média de absorbância obtida 4. Não misturar ou trocar diferentes lotes de reagentes. para cada padrão contra a sua concentração em pg/mL em papel 5. Os produtos contêm componentes preservados em azida sódica. milimetrado, com os valores de absorbância no eixo Y e as A azida sódica pode reagir com metais como cobre e chumbo, formando azida metálica explosiva. Quando em contato, lavar a 3. Usar a média dos valores de absorbância para cada amostra para determinar a concentração correspondente de Estradiol, em pg/mL, 6. A Solução de Parada é cáustica e corrosiva. Em caso de contato, lavar imediatamente o local afetado com água em profusão. Em 4. Para amostras diluídas, calcular o resultado final multiplicando-se caso de ingestão acidental, procurar auxílio médico imediato. Não o valor obtido pelo fator de diluição. COLETA DE AMOSTRA E PREPARAÇÃO
EXEMPLO DE CURVA PADRÃO
Atenção: os valores de D.O. são apenas ilustrativos e não devem ser
usados para cálculo de determinações. Cada laboratório deve 2. Não é necessário nenhum tratamento prévio da amostra. 3. As amostras de soro ou plasma devem ser armazenadas entre 2 e 8°C por até 24 horas, e devem ser congeladas a −10°C ou menos para períodos mais longos. Amostras congeladas devem ser misturadas por inversão várias vezes após seu descongelamento. Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos de amostras. 4. Amostras fortemente hemolisadas ou fortemente lipêmicas podem 5. Atenção: Amostras contendo azida sódica não devem ser
PREPARAÇÃO DOS REAGENTES
1. Todos os reagentes deverão estar em temperatura ambiente antes 2. Amostras com concentrações de Estradiol acima de 1000 ng/ml, Notas de Procedimento
- Não se recomenda a utilização de mais de 32 cavidades para
cada ensaio, principalmente pa ra pipetagem manual. - Cada pipetagem, após iniciada não deve ser interrompida.
- Utilizar preferencialmente uma pipeta multi-canal para adicão
Concentração de Estradiol (pg/ml)
VALORES ESPERADOS
Recomendamos o uso de soro controle disponível no Mercado. O kit de Estradiol também contém os controles, níveis 1 e 2. Estes valores de referência devem ser considerados apenas como orientação.Cada laboratório deve estabelecer seus próprios valores de referência, baseado em sua população. REFERÊNCIAS
1. Tsang, B.K., Armstrong, D.T. and Whitfield, J.F., Steroid biosyntheses by isolated human ovarian fol icular cel s in vitro, J. Clin. Endocrinol. Metab. 51:1407-1411 (1980) 2. Gore-Langton, R.E. and Armstrong, D.T., Fol icular steroidogenesis and its control. In: The Physiology of Reproduction, Ed.: Knobil, Fase ovulatória: antes da fase folicular 30-100 pg/mL E., and Neil , J. et al., pp. 331-385. Raven Press, New York (1988) Fase ovulatória: após a fase folicular 100-400 pg/mL 3. Hal , P.F., Testicular Steroid Synthesis: Organization and Regulation. In: The Physiology of Reproduction, Ed.: Knobil, E., and Neil , J. et al., pp 975-998. Raven Press, New York (1988) 4. Si teri, P.K. Murai, J.T., Hammond, G.L., Nisker,J.A., Raymoure, Pré-puberdade / crianças (normal) < 10 pg/mL W.J. and Kuhn, R.W., The serum transport of steroid hormones, Rec. Prog. Horm.Res. 38:457-510 (1982) 5. Martin, B., Rot en, D., Jolivet, A. and Gautray, J.P., Binding of CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
steroids by proteins in fol icular fluid of the human ovary, J.Clin. SENSIBILIDADE:
6. Baird, D.T., Ovarian steroid secretion and metabolism in women. O limite de detecção do método é igual 1 pg/mL. In: The Endocrine Function of the Human Ovary. Eds.: James, ESPECIFICIDADE:
V.H.T., Serio, M. and Giusti, G. pp 125-133, Academic Press, New A tabela abaixo demonstra a relação de reação cruzada entre Estradiol 7. McNast y, K.P., Baird, D.T., Bolton, A., Chambers, P., Corker, C.S. Reação cruzada(%) Concentração de Estradiol observada and McLean, H., Concentration of oestrogens and androgens in human ovarian venous plasma and fol icular fluid throughout the menstrual cycle, J. Endocrinol. 71:77-85 (1976). Esteróides
Reação cruzada
8. Abraham, G.E., Odel , W.D., Swerdlof , R.S., and Hopper, K., Simultaneous radioimmunoassay of plasma FSH, LH, progesterone, 17-hydroxyprogesterone and estradiol-17B during the menstrual cycle, J.Clin. Endocrinol. Metab. 34:312-318 (1972). 9. March, C.M., Goebelsmann, U., Nakumara, R.M., and Mishel , D.R., Roles of Oestradiol and progesterone in eliciting midcycle luteinising hormone and fol icle stimulating hormone surges. J. Clin. 10. Simpson, E.R., and McDonald, P.C., Endocrinology of Pregnancy. In: Textbook of Endocrinology, Ed.: Wil iams, R.H., pp412-422, 11. Jenner, M.R., Kelch, R.P., et al., Hormonal changes in prepubertal children, pubertal females and in precocious puberty, premature thelarche, hypergonadoism and in a child with feminising LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
12. Goldstein, D. et al., Correlation between estradiol and progesterone 1. Resultados confiáveis e reprodutíveis serão obtidos se o in cycles with luteal phase deficiency, Fertil. Steril. 37:348-354 procedimento do teste for seguido com o completo entendimento das instruções de uso e de acordo com as boas práticas 13. Kirschner, M.A., The role of hormones in the etiology of human breast cancer, Cancer 39:2716-2726 (1977). 2. O procedimento de lavagem é importante. Lavagens insuficientes 14. Odel , W.D. and Swerdlof , R.D., Abnormalities of gonadal function 3. A homogeneização, após a adição de cada reagente, deve ser 15. McDonald, P.C., Madden, J.C., Brenner, P.F., Wilson, J.D. and bem feita e é essencial para o bom desempenho do kit. Si teri, P.K. Origin of oestrogen in normal men and women with testicular feminisation, J.Clin. Endocrinol. Metabl 49:905 (1979). 4. Como em outros ensaios sorológicos, os resultados deste teste 16. Peckham, M.J. and McElwain, T.J., Testicular tumors, J. Clin. devem ser analisados em conjunto com outras informações disponíveis para se definir uma evolução clínica e o diagnóstico. 17. Taubert, H.D., and Dericks-Tan, J.S.E., Induction of ovulation by clomiphene citrate in combination with high doses of estrogens or nasal application of LH-RH. In: Ovulation in the Human. Eds.: CONTROLE DE QUALIDADE
Crosignandi, P.G. and Mishel ,D.R., pp.265-273,Academic Press,New York (1976). As boas práticas laboratoriais requerem que os controles sejam 18. Fishel, S.B., Edwards, R.G., Purdy, J.M., Steptoe, P.C., Webster, J. passados em cada curva de calibração. Um número significativo de Walters, E., Cohen, J. Fehiliy, C. Hewit , J., and Rowland, G., controles deve ser testado para se estabelecer os valores médios e os Implantation, abortion and birth after in-vitro fertilization using the limites aceitáveis para o seu desempenho. natural menstrual cycle or fol icular stimulation with clomiphene citrate and human menopausal gonadotropin, J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 1:24-28 (1985). 19. Wramsby, H., Sundstorm, P. and Leidholm, P., Pregnancy rate in relation to number of cleaved eggs replacecd after in vitro-fertilisation of stimulating cycles monitored by serum levels of estradiol and progesterone as sole index. Human Reproduction 2:325-328 (1987) 20. Ratclif ,W.A.,Carter,G.D.,etal.,Estradiol assays:applications and guidelines for the provision of clinical biochemistry service, Ann. Clin. Biochem. 25:466-483 (1988). 21. Tietz,N.W. Textbook of Clinical Chemistry. Saunders. 1986. 22. USA Center for Disease Control/National Institute of Health Manual, “Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, 1984. Fabricado por:
BioCheck, Inc.
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